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Dec 16, 2023

Arquitectura del hemo

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5190 (2023) Cite este artículo 670 Accesos 5 Detalles de Altmetric Metrics Los citocromos c mono y multihemicos maduran postraduccionalmente mediante

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 5190 (2023) Citar este artículo

670 Accesos

5 altmétrico

Detalles de métricas

Los citocromos c mono y multiheme maduran postraduccionalmente mediante la unión covalente del hemo. Para ello, Escherichia coli emplea el tipo más complejo de maquinaria de maduración, el sistema Ccm (para la maduración del citocromo c). Consta de dos complejos de proteínas de membrana, uno de los cuales transporta hemo a través de la membrana hasta una chaperona móvil que luego entrega el cofactor al segundo complejo, una apoproteína:hemo liasa, para su unión covalente. Aquí presentamos estructuras microscópicas crioelectrónicas del complejo de translocación del hemo CcmABCD de E. coli, solo y unido a la chaperona del hemo CcmE. CcmABCD forma un complejo heterooctamérico centrado alrededor del transportador ABC CcmAB que por sí solo no transporta hemo. Nuestros datos sugieren que el complejo desplaza un grupo hemo desde el velo interno al externo en sus interfaces CcmBC, impulsado por la hidrólisis de ATP en CcmA. Un motivo conservado de manejo del hemo (WxWD) en el lado periplásmico de CcmC rota el hemo 90° para una unión covalente a la chaperona hemo CcmE que encontramos interactuando exclusivamente con la subunidad CcmB.

Los citocromos c son una familia diversa y versátil de metaloproteínas presentes en todos los reinos de la vida1. Contienen una o varias copias del cofactor tetrapirrol Fe-protoporfirina IX, o hemo, y su característica definitoria es la unión covalente de este resto metaloorgánico a motivos de unión característicos de la secuencia C-Xn-CH (más comúnmente n = 2; Suplementario). Figura 1a)2. El propósito de esta modificación postraduccional es al menos doble. Primero, los citocromos c se despliegan invariablemente en un ambiente extracitoplasmático, de modo que la unión covalente sirve para prevenir la pérdida de cofactor. En segundo lugar, fijar los grupos hemo a la cadena peptídica alivia la necesidad de formar bolsas de unión voluminosas, lo que permite una relación cofactor:proteína muy alta y, con ello, la formación de cadenas apretadas de grupos hemo dentro de una sola proteína3. En consecuencia, las funciones típicas de los citocromos c son la transferencia de electrones o la catalización de reacciones redox multielectrónicas4. Podría decirse que el miembro más destacado de esta familia de proteínas es el monohema citocromo c de la cadena respiratoria mitocondrial, donde transporta electrones desde el complejo citocromo bc1 a la citocromo c oxidasa5. Sin embargo, los procariotas han desarrollado sistemas de complejidad mucho mayor6, con varios y hasta docenas de grupos hemo en una sola cadena peptídica. Organismos seleccionados como Geobacter sulfurreducens codifican más de cien citocromos c multihema en su genoma7. La maduración de los citocromos c es elaborada. Los apocitocromos contienen una secuencia señal para la exportación desde el citoplasma a través del translocón Sec, y la cadena peptídica naciente es luego procesada en el compartimento extracitoplasmático por un complejo hemo liasa que reconoce los motivos de unión al hemo y media la unión covalente del cofactor mediante añadiendo los dos grupos tiol de cisteína a sus cadenas laterales de vinilo. Lo más sorprendente es que este proceso es independiente de la secuencia general de la proteína y funciona para apocitocromos de tamaños muy diferentes. La cadena peptídica es escaneada por la liasa que reconoce específicamente motivos de unión al hemo. En todas las hemo liasas conocidas, las proteínas de la familia de 'manejo del hemo' desempeñan un papel crucial, y su sello distintivo es un motivo rico en triptófano, abreviado como 'motivo WxWD', mediante el cual los cofactores se mantienen y posicionan para interactuar con la proteína8 . Como los citocromos c son una familia de proteínas evolutivamente antigua, las madurasas se han diversificado con el tiempo y las clasificaciones actuales enumeran cinco sistemas diferentes de hemo liasas9,10. El más complejo de ellos es el sistema I, el sistema Ccm (para la maduración del citocromo c) que se encuentra en proteobacterias α y β, mitocondrias de plantas, deinococos, arqueas y algunas proteobacterias γ y δ. En la mayoría de los casos, está codificado en un solo operón de la composición ccmABCDEFGHI (Figura complementaria 1b), cuyos productos proteicos forman dos complejos proteicos integrales de membrana con funcionalidad distinta11. Aquí, un complejo CcmFHI sirve como módulo de hemo liasa que escanea el apopéptido, reduce los disulfuros que pueden haberse formado en el ambiente oxidante a través de un módulo de tiorredoxina y une cofactores de hemo en la subunidad central de liasa CcmF12,13. CcmG es una tiorredoxina similar a DsbA que proporciona equivalentes reductores al complejo liasa. El segundo módulo es CcmABCD, otro complejo proteico integral de membrana centrado en el transportador ABC CcmAB. Se describió como un exportador de hemo que transloca los cofactores a través de la membrana para unirlos a la chaperona hemo CcmE en el periplasma14. CcmE es una proteína de membrana monotópica que se pliega en un dominio compacto de barril β y forma un enlace covalente al hemo con un residuo de histidina ubicado en su cola C-terminal flexible15,16. CcmE es el elemento que conecta el complejo de translocación del hemo CcmABCD y el complejo de hemo liasa CcmFHI17, y aunque CcmF invariablemente contiene un grupo hemo de tipo b, solo los cofactores administrados a través de CcmE están unidos a las cadenas de apocitocromo (Figura complementaria. 1c).

Recientemente hemos informado de la estructura de una subunidad central de la hemo liasa, la proteína CcmF de Thermus thermophilus, determinada mediante cristalografía de rayos X18. La estructura reveló un pliegue sin precedentes para las proteínas de membrana y mostró el grupo hemo accesorio de tipo B ubicado en la parte inferior de un canal en forma de embudo que parece abarcar toda la membrana. Sin embargo, mientras que el hemo de tipo b estaba ubicado dentro de la valva citoplasmática, el lado periplásmico del canal tenía una amplia abertura lateral hacia la membrana. Basándonos en el tamaño y la forma de esta entrada y la cavidad proteica adyacente, propusimos un "modelo de boya" para la acción de CcmE, donde la chaperona en realidad no extrae el grupo hemo en el periplasma, sino que retiene el cofactor hidrofóbico dentro del lípido. bicapa para guiarlo hacia la abertura en CcmF18. Para aclarar cómo funciona CcmE junto con la liasa, procedimos a investigar la otra interacción clave de la chaperona, su carga con hemo en el complejo CcmABCD. En este trabajo, producimos y aislamos complejos CcmABCD y CcmABCDE de la γ-proteobacteria Escherichia coli y determinamos su estructura mediante análisis de partículas individuales por microscopía crioelectrónica (crio-EM). Más recientemente, Kranz, Zhang, Zhu y sus colaboradores también informaron sobre estructuras de un complejo Ccm(AB)2CD de E. coli19. En cambio, encontramos una estequiometría predominante con dos copias de CcmCD e identificamos el modo de unión de la chaperona CcmE a este complejo. Nuestros datos respaldan aún más el modelo de boya de acción de CcmE y sugieren que este transportador ABC inusual actúa como una hemo flopasa.

E. coli utiliza un operón ccmABCDEFGH para la maduración del citocromo c, en el que la proteína CcmH representa una fusión de las proteínas CcmH y CcmI que se encuentran por separado en otros organismos que emplean el sistema I20. El procariota modelo codifica sólo seis citocromos de tipo C en su genoma que se producen exclusivamente durante el crecimiento anaeróbico. Para permitir la producción recombinante de citocromos de tipo c en condiciones óxicas, Thöny-Meyer y sus colaboradores han creado el plásmido accesorio pEC86 que expresa el sistema Ccm a partir de un promotor constitutivo en trans21. Aquí generamos una serie de construcciones de expresión para componentes del sistema Ccm de E. coli y aislamos un complejo CcmABCDE que se solubilizó con DDM o GDN y se aisló mediante cromatografía de afinidad y exclusión por tamaño (Figuras complementarias 2a, b). Luego, esta muestra se caracterizó mediante análisis crio-EM de una sola partícula y se refinaron las clases que representan un complejo Ccm(ABCD)2 y Ccm(ABCD)2E (ver más abajo), lo que condujo a modelos estructurales con resoluciones de 3,47 Å y 3,81 Å. (Figura complementaria 3).

Las proteínas CcmA y CcmB son los respectivos módulos ABC y subunidades transmembrana de un transportador ABC canónico. Originalmente se sugirió que actuaran como exportadores de hemo14, ensamblando un heterotetrámero Ccm(AB)2 de acuerdo con los principios arquitectónicos canónicos de los transportadores ABC. Luego se descubrió que el tetrámero formaba un complejo con la proteína CcmC que maneja el hemo y que contiene el motivo WxWD17, y el pequeño pero esencial monotópico CcmD22. En consonancia con esto, el reciente análisis crio-EM informó un complejo Ccm(AB)2CD19 que anteriormente fue predicho con bastante precisión por AF2Complex23, que a su vez se basa en AlphaFold24. En nuestro análisis, la unidad Ccm(AB)2 también está en el núcleo del complejo, pero ya en las clases 2D iniciales se hizo evidente de inmediato que el conjunto era simétrico (Fig. 1a), con módulos CcmCD en ambos lados del núcleo. transportador, lo que da como resultado un heterooctámero Ccm (ABCD) 2 con una masa total de 164 kDa y 26 hélices transmembrana (Fig. 1b, c; Fig. complementaria 4). El transportador ABC estaba en un estado libre de nucleótidos, abierto hacia adentro, sin contacto directo entre las dos subunidades CcmA de unión a nucleótidos. El CcmA de 201 aa alcanzó el pliegue canónico del dominio ABC relacionado con las ATPasas de bucle P, con un bucle P (motivo Walker A) 36GSNGAGKT43 que forma el sitio de unión de nucleótidos, así como una región de cambio I 179GIVLTTHQP188 y una región de cambio II ( Motivo Walker B) 152LDEPFTAIDV161 que normalmente sufre cambios conformacionales tras la unión de nucleótidos, y el bucle de tapa 81IGHQPGIKTRL91 que es crucial para la interacción con CcmB (Fig. 1d). En todos los motivos, los residuos conservados que aparecen en negrita están implicados en la unión de MgATP. En el estado libre de nucleótidos del complejo no hubo interacciones directas entre las dos copias de CcmA, sus centros de masa estaban separados por 36 Å.

Las clases 2D del conjunto de datos CcmABCD mostraron una envoltura simétrica en una micela elíptica. b Reconstrucción de una sola partícula de Ccm (ABCD) 2 libre de nucleótidos con una resolución de 3,47 Å en vista frontal (arriba) y superior desde el periplasma (abajo). En la representación esquemática de la derecha están etiquetadas las subunidades, así como las caras frontal y posterior de la interfaz CcmBC. c Representación en caricatura del complejo de 194 kDa en la membrana. Coloración de subunidades según (b). d La subunidad CcmA de la ATPasa en estado libre de nucleótidos, coloreada desde azul en el extremo N hasta rojo en el extremo C. Se indican los motivos conservados de las ATPasas de bucle P, así como los residuos discutidos en el texto. e CcmB, la subunidad transmembrana del transportador ABC central. Se etiquetan las hélices de TM y se indica la posición de la membrana y de las subunidades CcmA y CcmB' adyacentes. f La subunidad de translocación del hemo CcmC, con el motivo de manipulación del hemo WxWD en el bucle que conecta las hélices hIII y hIV de TM. g La subunidad CcmD, con una única hélice TM, estaba completamente definida y se extiende 35 Å hacia el citoplasma.

CcmB es una proteína de membrana integral con seis hélices α transmembrana y una “hélice de codo” anfipática característica en su extremo N, situada paralela al plano de la membrana y mantenida en su lugar mediante interacciones iónicas entre los D73 y K96 conservados, así como E10. y R68 (Fig. 1e). CcmB, que conecta las hélices hII y hIII en el lado citoplasmático de la membrana, contiene la hélice de acoplamiento característica de los residuos 78-84 que media la interacción de la subunidad transmembrana con la subunidad de unión a nucleótidos CcmA25. Filogenéticamente, CcmAB se agrupa con la familia de exportadores ABC-A2 de transportadores ABC26 o, según una clasificación más reciente, con los exportadores de tipo V (flopasas)27. Las citocromo c maturasas del sistema I también se encuentran en las mitocondrias de las plantas, y en Arabidopsis thaliana el gen de la ATPasa CCMA está codificado en el ADN nuclear, mientras que ccmB se encuentra en el genoma mitocondrial28. La proteína CcmC también es una proteína de membrana integral con seis hélices transmembrana (Fig. 1c). Junto con los componentes hemo liasa CcmF y Ccs(B)A constituye la familia de 'proteínas manipuladoras de hemo', con un motivo 114WXKXXWGXΩWXWDXRLT130 (numeración CcmC), abreviado 'WxWD', en la región del bucle que conecta las hélices transmembrana hIII y hIV en el lado periplásmico de la membrana (Fig. 1c, f)8. El residuo de aspartato terminal de este motivo, D126, cubre la hélice IV al aceptar enlaces cortos de hidrógeno de los átomos de nitrógeno de la amida de la cadena principal de los residuos A127 y R128 (ver más abajo), proporcionando una carga negativa para compensar el momento dipolar de la hélice en una disposición. muy similares a los observados en la estructura cristalina de CcmF de T. thermophilus18 y la estructura crio-EM de CcsBA29 (Figura complementaria 5). Se informó que la subunidad final del complejo, CcmD, era necesaria para la disociación de CcmE después de la transferencia del grupo hemo22,30. CcmD tiene su extremo N en el periplasma donde comienza con una hélice anfipática que coloca los primeros 18 residuos paralelos al límite de la membrana (Fig. 1g). Desde el residuo A18D al M41D, atraviesa la membrana exclusivamente con residuos hidrofóbicos, con la notable excepción de H38D que reside dentro de la membrana, aproximadamente a 5 Å de la cara citoplasmática. Al salir de la membrana, CcmD se extiende más de 35 Å hacia el citoplasma. Como lo indica el creciente desorden de los mapas crio-EM (Fig. 1g), el extremo C de CcmD es bastante flexible y nunca observamos una interacción directa con las subunidades CcmA cercanas. Sin embargo, el residuo R54D forma tres enlaces de hidrógeno cortos con la hélice corta en el extremo C de CcmC que también se orienta paralela a la cara citoplasmática de la membrana. Las muestras de CcmABCD / E se purificaron conjuntamente con hemo b unido en estado oxidado, como lo indica una banda α a 560 nm tras la reducción (Figura complementaria 2c). No se encontró hemo unido en los análisis estructurales de diferentes complejos, mientras que en el informe reciente se obtuvieron estructuras unidas a hemo sobre un complejo Ccm(AB)2CD, pero aquí se añadió hemina externa antes del análisis crio-EM19. No habíamos seguido esta estrategia y esto presumiblemente condujo a la pérdida del cofactor unido de forma no covalente durante la preparación de la red.

La arquitectura general del complejo CcmABCD en su estado libre de nucleótidos es, por tanto, un heterooctámero simétrico C2 con dimensiones de 100 Å × 80 Å × 60 Å. Contiene un surco pronunciado entre las subunidades CcmB, CcmC y CcmD en cada lado que está cubierto por el bucle WxWD de CcmC en la interfaz periplásmica. Para la siguiente discusión, designamos esta cara del complejo como "frente" y el lado opuesto, con una interfaz CcmBC bastante plana, su "parte posterior" (Fig. 1b).

Para obtener información estructural sobre el estado de CcmAB unido a ATP, generamos una variante E154QA que reemplazó el glutamato catalítico en la región del interruptor II de la subunidad de unión de nucleótidos (Fig. 1d) para obtener una proteína que es incapaz de hidrólisis de ATP pero todavía se une al nucleótido31,32. Esta variante se aisló como el tipo salvaje (Figura complementaria 2a, b), pero no contenía hemo unido (Figura complementaria 2d). Como se anticipó, la mutación puntual única en el sitio de unión de nucleótidos de CcmA bloqueó el transportador en una conformación cerrada, acortando la distancia entre los centros de masa para las dos subunidades de CcmA de 36 Å a 29,4 Å (Fig. 2a). No se unió ningún hemo en esta muestra, y obtuvimos un conjunto de datos que contenía CcmA sin y otro con ATP unido, con solo cambios menores en la conformación general del complejo (Tabla complementaria 1). Desde el estado abierto hacia adentro del heterotetrámero Ccm(AB)2 libre de nucleótidos, la variante E154QA cambió a una configuración completamente cerrada sin una cavidad interna de tamaño suficiente para acomodar una molécula de carga del tamaño de un cofactor hemo. Los sitios de unión para ATP estaban ubicados cerca de la interfaz del dímero CcmA (Fig. 2b), con el residuo S130 del otro monómero involucrado en la coordinación de los fosfatos de ATP. El ATP se unió a su posición canónica en esta clase de proteínas, con el bucle P acunando el trifosfato cerca de las regiones del interruptor I y del interruptor II y el bucle de la tapa (Fig. 2c). Los cambios conformacionales generales en los diferentes estados de CcmA fueron sutiles, y la estructura de tipo salvaje libre de nucleótidos (Fig. 2d) mostró la misma conformación del bucle P que la variante E154QA libre de nucleótidos (Fig. 2e), aunque este último puso el transportador en su estado cerrado. Solo tras la unión de MgATP, la conformación del bucle P cambió sustancialmente, incluso en el bucle de la tapa donde H83 coordinó el catión Mg2+ (Fig. 2f).

a Reconstrucción de una sola partícula de CcmAB libre de nucleótidos en estado abierto (izquierda) y de la variante E154QA unida a ATP en estado cerrado (derecha). b El dímero CcmA de la variante E154QA con 2 ATP unidos en la interfaz del dímero (gris). c Detalle del sitio de unión de ATP en un monómero de CcmA con los motivos funcionales de la familia P-loop NTPasa. d Conformación del bucle P en CcmA nativo (estado abierto). e Conformación del bucle P en la variante E154QA sin ATP unido. f Unión de ATP en la variante E154QA. g Comparación de las conformaciones del monómero CcmB interno y externo (Ref. Fig. 3a) en el tipo salvaje sin nucleótidos (gris) y la variante E154QA (negro). En el monómero externo, el cambio sustancial de la hélice hV sólo ocurre en el complejo asimétrico unido a ATP. h Imagen estéreo del cambio conformacional asimétrico observado en el monómero no obstruido de CcmB (transparente), superpuesto al segundo monómero que permaneció unido a CcmC (sólido). La extensión del hV de CcmB daría como resultado un choque estérico con la hélice hIV de CcmC.

Inesperadamente, la estequiometría general de CcmABCD cambió para la variante E154QA, en el sentido de que el cierre del transportador ABC central Ccm(AB)2 condujo consistentemente a la pérdida de una copia de CcmCD, lo que resultó en un complejo Ccm(E154QAB)2CD (Fig. .3a, figura complementaria 6, película complementaria 1). Este cambio fundamental en la estructura cuaternaria condujo a una asimetría estructural de los dos protómeros CcmB. El protómero interno de CcmB (Fig. 3a) conservó en gran medida su conformación de estado abierto, como fue el caso de las copias restantes adyacentes de CcmC y CcmD. Sin embargo, el protómero externo, ahora libre de interacciones con CcmCD, experimentó un cambio conformacional que afectó con mayor fuerza a los extremos citoplasmáticos de sus hélices transmembrana hI y hV (Fig. 2g). En el protómero externo del complejo variante E154QA, los extremos citoplasmáticos de ambas hélices se movieron hacia afuera desde el núcleo del dímero CcmB, 7,0 Å en el caso de hI y 8,1 Å para hV (Fig. 2g, h). Este último cambio habría causado un choque significativo con la hélice transmembrana VIH de CcmC y, por lo tanto, es la razón probable de la disociación de la segunda copia de CcmCD de un complejo Ccm (ABCD) 2 heterooctamérico (Película complementaria 2). La estequiometría de la subunidad alterada ahora también correspondía a la de las estructuras Ccm(AB)2CD recientemente reportadas, donde las estructuras AMPPNP- (PDB 7F03) y unidas a ATP (PDB 7F04) mostraron una conformación cerrada similar a la de nuestra variante E154QA, mientras que una La segunda reconstrucción 3D de la muestra unida a ATP con hemo unido se designó como semiabierta (PDB 7VFP), con una conformación muy similar al estado libre de nucleótidos determinado aquí19. Li y col. también informaron un estado abierto libre de nucleótidos con una distancia mayor entre las dos copias de CcmA (PDB 7VFJ). No encontramos esta forma, pero planteamos la hipótesis de que esta apertura más amplia del transportador solo puede ser posible debido a la ausencia de un segundo módulo CcmCD en sus preparaciones. Aunque los autores no lo discutieron, estas estructuras también mostraron una asimetría constante de las dos copias de CcmB que es menos pronunciada en la forma apo abierta del complejo (PDB 7VFJ). Sólo aquí, las hélices hI y hV apuntan hacia adentro, pero en ausencia de una segunda copia de CcmCD, la hélice hI está aún menos enterrada dentro del dímero CcmB que en nuestra estructura del complejo simétrico Ccm(ABCD)2. En todas las demás estructuras, las hélices hI y hV apuntaban hacia afuera únicamente en el protómero externo no restringido, lo que por lo tanto también puede haber contribuido a la liberación de una segunda copia de CcmCD que dio lugar a los complejos asimétricos observados.

Una reconstrucción de una sola partícula y una representación esquemática del complejo Ccm(AB)2CD aislado para la variante E154QA en la vista frontal (arriba) y superior (abajo). b Hemo unido a CcmC en una estructura de un complejo Ccm(AB)2CD de E. coli (PDB 7VFP). Coloración de subunidades según publicación original. c Disposición del bucle flexible 5 en CcmC sin (arriba) y con hemo unido (abajo, PDB 7VFP). d Reorientación de la hélice hV y el bucle 5 en la predicción AlphaFold2 (verde) en relación con la estructura experimental con ATP unido (blanco). e Superposición de la predicción AlphaFold2 (verde) con hemo unido en PDB 7VFP a H60 únicamente (negro). En la predicción in-silico, la posición de H184 lo convierte en un ligando axial distal adecuado para el hierro hemo. f El motivo del haz de cuatro hélices alrededor del bucle WxWD en CcmC en la estructura compleja de ATP, coloreado desde el extremo N al C en una rampa de colores del arco iris.

En el lado extracelular de la membrana, la diferencia entre los estados abierto y cerrado de CcmAB fue mínima, y ​​ninguna configuración mostró un estado "abierto hacia afuera" ni presentó un sitio de unión aparente para una molécula de carga. Por el contrario, el cambio conformacional observado del protómero externo de CcmB en el estado unido a ATP o el complejo variante E154QA (Fig. 3a) implica que un protómero CcmC adyacente tendría que disociarse del complejo o cambiar su propia conformación en respuesta. (Fig. 2h, Película complementaria 2). En CcmC, el motivo de manejo del hemo 119WGTWWVWD126 forma el bucle que conecta las hélices hIII y hIV (Fig. 1f). En nuestras estructuras de CcmC, y también en las publicadas recientemente19, estas hélices estaban empaquetadas muy juntas y el bucle WxWD apuntaba hacia la cara frontal del complejo. En las estructuras informadas de un complejo Ccm (AB) 2CD con hemo unido (PDB 7F04 y 7VFP), la posición de las hélices era similar, pero los cofactores del hemo estaban unidos a CcmC en la parte posterior del complejo (Fig. 3b). En general, las estructuras unidas al hemo 7F04 y 7VFP se alinean con el complejo simétrico Ccm(ABCD)2 presentado aquí con un desplazamiento cuadrático medio de sólo 3,8 Å para todos los átomos, pero las conformaciones de las subunidades individuales son más similares, con sólo 0,6 Å rmsd para CcmC, independientemente de la presencia de un hemo unido. El bucle WxWD no está en contacto con el grupo hemo y permanece casi sin cambios. Lo mismo se observó para el bucle 5, el tramo de proteína extendido y parcialmente desordenado que conecta las hélices hV y hVI de CcmC (Fig. 3c). Si bien este bucle no se resolvió completamente en ninguna de las estructuras, las posiciones de las dos histidinas de CcmC que se unen al hemo, H60 y H184, son en gran medida idénticas. En 7F04, solo H60 coordina el hierro hemo, mientras que H184 apunta hacia CcmB (Fig. 3c).

Luego procedimos a realizar varias predicciones estructurales del complejo CcmABCD con AlphaFold2 en modo multímero24. Las estructuras predichas estaban muy en línea con las experimentales, pero exhibieron varias diferencias potencialmente relevantes. Las ejecuciones individuales de AlphaFold2 produjeron predicciones casi idénticas para subunidades individuales, de modo que este análisis se centra en el conjunto más grande, un complejo simétrico Ccm (ABCDE) 2 (Fig. 3d). El modelo tenía el transportador ABC central Ccm(AB)2 en un estado cerrado, muy similar al complejo variante E154QA unido a ATP. Sin embargo, en el ensamblaje simétrico las hélices hI y hV de las subunidades CcmB no se proyectaron hacia afuera, por lo que el modelo AlphaFold2 no reprodujo esta característica clave de las estructuras experimentales de estado cerrado. La subunidad CcmC predicha difería más fuertemente de la de cualquiera de las estructuras experimentales (Figura 5 complementaria), y además de un desplazamiento del bucle WxWD de aproximadamente 1,5 Å, esta diferencia se debió principalmente a una inclinación importante de la mitad periplásmica de la hélice. hV de CcmC (Fig. 3d). Con esta inclinación, el bucle extendido 5 se dobló hacia CcmC, lo que provocó un desplazamiento de H184 de 18 Å, lejos de su posición cercana a CcmB en las estructuras experimentales (Fig. 3e). Aunque las predicciones de AlphaFold2 actualmente no incluyen cofactores, las dos histidinas previamente identificadas para actuar como ligandos axiales del hemo, H60 y H184, se yuxtapusieron directamente y serían muy adecuadas para ligar conjuntamente el hemo que está unido de un modo similar al de la estructura 7F04 ( Figura 3f)23. Una predicción de AlphaFold2 de solo la subunidad CcmC mostró exactamente la misma conformación, lo que subraya que esta predicción no se basa en la formación de un complejo con CcmB. Además, H184 ahora formó un enlace de hidrógeno desde su átomo Nδ1 al β-carboxilato de D126 del motivo WxWD (Fig. 3e). La predicción AlphaFold para CcmC también se puede comparar directamente con la estructura experimental de una conformación abierta del sistema II hemo liasa CcsBA de Helicobacter hepaticus29. En esta estructura (PDB 7S9Y), el hemo se une al lado periplásmico de la proteína de membrana integral, con H761 y H897 como ligandos axiales (Figura complementaria 5e). Como se señaló anteriormente33,34, la familia de proteínas que manejan el hemo comparte un núcleo de plegado común, y las hélices hII-hV de CcmE se alinean bien con las hélices hIX-hXII de la 13-TM-helix CcsBA liasa29, y con las hélices hV-hVIII de CcmF (Figura complementaria 5c) 18. La parte central de este haz de cuatro hélices consecutivas, el bucle 2 (que conecta la segunda y la tercera hélice) en el lado periplásmico de la membrana es la que contiene el motivo WxWD, mientras que los ligandos de histidina axiales para el cofactor hemo residen en la primera hélice. y en el bucle 4, respectivamente. El dominio se abre hacia el lado periplásmico, y aquí el grupo hemo unido está acunado en las estructuras de CcsBA (PDB 7S9Y) y CcmC (PDB 7F04). Tenga en cuenta que en CcsBA el hemo se transporta presumiblemente a través de un canal formado por las hélices N-terminales de la proteína (una proteína CcsB separada en otros organismos), y que en CcmF la entrega de hemo desde la chaperona CcmE probablemente ocurre a través de una puerta lateral en el C -parte terminal de CcmF18. En cualquier caso, el cofactor llega al otro lado del motivo WxWD que luego podría actuar para agarrar el anillo de porfirina mediante el apilamiento aromático con sus residuos de triptófano. Todo esto está en línea con una función consistente del motivo WxWD al rotar el grupo hemo aproximadamente 90° y moverlo a la posición de retención observada en las dos estructuras analizadas anteriormente, de modo que su grupo 8-vinilo apunte hacia el periplasma. A medida que la liasa forma el enlace covalente con el cofactor, este grupo 8-vinilo es atacado primero por la segunda cisteína de un motivo de unión al hemo en el apocitocromo, mientras que CcmE en el sistema I está unido al hemo a través de su grupo 3-vinilo35,36. . Para el presente análisis del complejo Ccm(ABCD)2, esto sugiere que el hemo en la estructura 7F04 también se observa en un bolsillo de unión al que llega después de pasar a través del motivo WxWD. Para esto, las hélices hIII y hIV de CcmC que conecta este motivo están demasiado cerca en toda la estructura conocida del dominio central de manejo del hemo, lo que implica un reordenamiento conformacional durante el manejo del hemo (ver Discusión).

La construcción utilizada para producir el complejo CcmABCD de E. coli también contenía el gen ccmE que codifica la chaperona hemo CcmE que recibe el cofactor del complejo CcmABCD y lo transporta al complejo hemo liasa CcmFH(I)37,38. CcmE es una proteína de membrana monotópica con un dominio de barril β periplásmico que se ha caracterizado previamente mediante espectroscopia de RMN16,39 y se une covalentemente al grupo hemo que recibe del complejo CcmABCD a través del H130 conservado en su extremo C, mientras que se sugirió el residuo Y134. para servir como ligando axial15,38. En nuestros datos de partículas individuales crio-EM del complejo nativo, las dos clases 3D con mayor resolución contenían el complejo Ccm(ABCD)2 (Figura complementaria 3), pero una de ellas presentaba además un dominio periplásmico prominente que, después del refinamiento, se modeló. como CcmE con su hélice transmembrana N-terminal (Fig. 4a). Esta hélice interactuó exclusivamente con la hélice hVI de CcmB, con el dominio periplásmico de CcmE colocado sobre la interfaz de CcmBC en un lado del complejo (Fig. 4b, Película complementaria 3). Aunque la interfaz observada fue pequeña, la interacción de CcmB con CcmE quedó bien resuelta en los mapas. El 29 % de todas las partículas utilizadas para el refinamiento final contenían CcmE, y aunque en niveles de contorno inferiores era evidente una segunda copia del acompañante en el lado opuesto del complejo y la hélice N-terminal de CcmE era visible en reconstrucciones de menor resolución durante procesamiento de datos (Fig. 4c), la clase relevante contenía predominantemente una única copia de CcmE, con una resolución local ligeramente menor (Fig. 3 complementaria) y presumiblemente ocupación subestequiométrica. La hélice transmembrana de CcmE se modeló a partir del residuo N2 al S32 y está seguida por una bisagra corta y flexible que precede al dominio del barril β que comienza en F37. Los residuos de coordinación del hemo H130 e Y134 estaban frente a la membrana pero estaban situados encima de CcmB en lugar de CcmC (Fig. 4b). La asociación de CcmE al complejo tampoco pareció afectar su estructura y no se observaron cambios discernibles en CcmB.

una clase 3D del conjunto de datos de tipo salvaje que contenía CcmE enlazado en la vista frontal (arriba) y superior (abajo). b Posición de CcmE en la parte posterior del complejo, con la hélice TM de CcmE en contacto exclusivo con la hélice VIH de CcmB. c Corte central a través de una clase 3D de baja resolución (8 Å) de CcmABCDE, que muestra las hélices transmembrana del complejo y su asignación a subunidades. Tenga en cuenta que la hélice TM adicional de CcmE es visible a ambos lados del complejo. d Modelo AlphaFold2 de un complejo Ccm (ABCDE) 2, que concuerda con los datos experimentales (Figura complementaria 7). e La principal diferencia entre la estructura experimental y el modelo AlphaFold2 está en el posicionamiento del dominio periplásmico de CcmE que en la predicción gira 90 ° hacia CcmC. f Detalle de la interfaz CcmCE de la predicción AlphaFold2. Los supuestos ligandos del hemo H60 y H184 están yuxtapuestos (Fig. 3e), y H130 e Y134 de CcmE que participan en la unión del hemo están cerca del sitio de unión del hemo.

AlphaFold2 produjo un modelo de un complejo Ccm (ABCDE) 2 simétrico (Fig. 4d) con una desviación cuadrática media de la estructura experimental de 3.1 Å para todos los átomos (Fig. 7 complementaria) que también reprodujo la asociación observada de CcmE. muy bien al núcleo heterooctamérico. En la predicción, dos copias de CcmE se unieron periféricamente a CcmB, y el modo de unión para la hélice N-terminal de CcmE coincidió con precisión con el observado en nuestro análisis crio-EM. Esto no era necesariamente esperado dada la interacción débil y posiblemente transitoria de CcmE con CcmC. Sin embargo, el dominio periplásmico de CcmE se giró aproximadamente 90 ° hacia CcmC, colocándolo por encima del bucle 5 y el motivo WxWD de este último (Fig. 4e). En el modelo AlphaFold, el residuo receptor de hemo H130E se apiló en W119C del motivo WxWD extendido (Fig. 4f), en una posición muy adecuada para atacar al grupo hemo si se une como se ve en PDB 7F04 (Fig. 3e, Película complementaria 3). En la estructura experimental, el dominio periplásmico de CcmE mostró una movilidad mejorada y una resolución local más baja que el complejo central, lo que no es sorprendente en ausencia de un grupo hemo unido. De acuerdo con el papel de CcmE en nuestro modelo de boya de transporte de hemo desde la translocasa Ccm(ABCD)2 a la liasa CcmFGH(I), no se requiere que holo-CcmE alcance una conformación rígida, ya que el cofactor hemo nunca se extrae completamente de la membrana18.

Las conformaciones abierta y cerrada de CcmABCD aquí reportadas confirman el trabajo reciente de Li y colaboradores19, pero difieren en varios aspectos de posible relevancia funcional. Lo más obvio es que hemos aislado un complejo heterooctamérico Ccm (ABCD) 2 como especie predominante en el estado libre de nucleótidos, mientras que las estructuras informadas anteriormente solo contenían consistentemente una copia de CcmC y CcmD. Las razones de esta diferencia no son obvias. Ambos grupos clonaron un fragmento de ADN genómico policistrónico de E. coli con una etiqueta de afinidad N-terminal añadida en CcmA y solubilizaron la fracción de membrana con 1% de DDM. En nuestro caso, se usó un StrepTag (II) y las células se rompieron mediante sonicación, mientras que Li y sus colaboradores usaron una etiqueta de hexahistidina y un microfluidizador para la lisis celular. Nuestros pasos de centrifugación fueron más cortos y cambiamos el detergente por el análogo sintético de la digitonina glicodiosgenina (GDN), pero por lo demás ambos enfoques eran similares y parecen compatibles, lo que plantea la cuestión de qué estequiometría es fisiológicamente correcta. Consideramos que es más probable perder subunidades que ganarlas, pero a falta de más pruebas, esto no es un punto fuerte. Sin embargo, inesperadamente también obtuvimos un complejo Ccm(AB)2CD al analizar la variante E154QA que es deficiente en la hidrólisis de ATP y conduce a un estado cerrado del módulo transportador ABC. El cierre del transportador dimérico indujo un cambio conformacional de las hélices hI y hV en solo un monómero del dímero CcmB que no es compatible con el modo de unión observado de CcmC a CcmB (Fig. 2h), como en el lado citoplasmático de la membrana. , la hélice hV de CcmB fue empujada hacia afuera, lo que provocó un choque con la hélice hIV de CcmC (Fig. 2h). Parece factible que tal reordenamiento dé como resultado la expulsión efectiva del módulo CcmCD del complejo, y es bastante notable que ocurra solo en un protómero del dímero CcmB, mientras que el otro conserva casi por completo su conformación de estado abierto con CcmCD. en su lugar. Sin embargo, tenga en cuenta que todos los análisis se llevaron a cabo con complejos de membrana solubilizados, de modo que se pierde un aspecto importante de una membrana biológica: la presión lateral de la bicapa lipídica. Esta característica se ha discutido más a fondo en el contexto de los canales mecanosensibles40, pero es una propiedad general que depende de la composición lipídica y la forma de la membrana. La pérdida de presión de la membrana lateral en una micela de detergente puede desestabilizar el complejo CcmABCD, dando como resultado la disociación de una unidad CcmCD. Si es así, ¿qué sucede en un entorno nativo donde la membrana puede mantener intacto un complejo octamérico? Si CcmC no se disocia, debe acomodar la hélice hV que sobresale de CcmB dislocando su propia hélice hIV (Fig. 2h). Esta hélice está conectada a su hélice adyacente hIII en el lado periplásmico a través del bucle que contiene el motivo WxWD, y para que el cofactor hemo manejado por este motivo pase desde el lado frontal al posterior de CcmC, como se sugirió anteriormente, la distancia entre estas dos hélices de CcmC deben aumentar transitoriamente. La reorganización de Ccm(AB)2 al cerrarse puede proporcionar exactamente la fuerza impulsora necesaria para desencadenar esta secuencia de eventos. Esto implica la existencia de una segunda conformación de CcmC que permanece no observada hasta la fecha y que podría ser difícil de identificar debido a su naturaleza transitoria. En esta conformación, el hemo podría pasar entre las dos hélices y debajo del bucle WxWD, probablemente intercalado por las dos cadenas laterales de triptófano de este último. En este proceso, el cofactor gira y sus cadenas laterales de propionato cargadas se giran hacia la membrana. Esta posición debería ser desfavorable en el entorno hidrofóbico de la membrana, pero en CcmC el hemo en su posición de unión ya está ligeramente elevado fuera de la membrana, con una cadena lateral de propionato formando un puente salino con la arginina R128. La rotación del grupo hemo es fundamentalmente importante, ya que tanto CcmE en el complejo hemo translocasa como el apopéptido en el complejo liasa deben atacar las cadenas laterales de vinilo que estarían profundamente enterradas dentro de la membrana en la orientación energéticamente más favorable del cofactor dentro de la membrana. bicapa lipídica.

En su manuscrito reciente, Li et al. describen CcmABCD como un 'complejo de liberación de hemo', lo que implica que la entalpía libre de la hidrólisis del ATP se utiliza para unir covalentemente el hemo de carga a CcmE y expulsarlo de la membrana19. Esto se basa en el hallazgo establecido de que incluso en ausencia de CcmAB, un complejo CcmCDE une el hemo de forma covalente a la chaperona CcmE17,37. Sin embargo, la conformación transitoria y no observada hasta ahora de CcmC que sugerimos con base en el razonamiento anterior sería aquella en la que el cofactor puede interactuar directamente con el motivo WxWD en CcmC. Dada la analogía con CcmF y CcsBA, esto debería ocurrir antes de que el grupo hemo alcance el bolsillo de unión observado en las estructuras Ccm y Ccs (Figura complementaria 5). En este modelo, la hidrólisis de ATP sirve para cambiar la conformación de CcmC de modo que sus hélices hIII y hIV se separen lo suficiente como para que un grupo hemo pase por debajo del bucle WxWD y se gire para permitir que H130E se una al grupo 3-vinilo. Ambas hipótesis no son contradictorias: el transporte de un cofactor hemo hacia y a través del motivo WxWD bien puede coordinarse con la expulsión de otro que ya está presente en el sitio de unión del ciclo anterior, y la hidrólisis de ATP entonces también expulsaría el cofactor. cofactor después de su unión a CcmE. La pregunta clave es dónde reside el grupo hemo antes de interactuar con el motivo WxWD de CcmE. El hemo libre se divide fácilmente en una membrana biológica con los grupos propionato cargados orientados hacia la interfaz membrana-agua18. Como cualquier anfífilo, el cofactor tendrá buena movilidad lateral dentro de la bicapa lipídica, pero enfrentará una barrera de alta energía para que los propionatos crucen desde la valva interna a la externa, por lo que los eventos flip-flop serán raros. Proponemos que es en este paso donde entra en juego el complejo Ccm(ABCD)2, actuando como una flopasa que transloca un grupo hemo desde el interior de la valva hacia el exterior y luego lo pasa a través del bucle WxWD hasta CcmE. Como han demostrado los estudios de eliminación del CcmAB, esto no parece ser indispensable y todavía se forma un complejo CcmCDE detenido17,37, pero esto sólo requeriría cantidades minúsculas de hemo presente en la valva externa, lo que bien puede lograrse a través de otras vías o ocurren espontáneamente. Filogenéticamente, CcmAB se agrupa con otros transportadores ABC que actúan como flopasas, con estructuras conocidas para el transportador de antígeno O Wzm-Wzt41 y el exportador de ácido teicoico TarGH42. Sin embargo, nos abstenemos de exagerar esta analogía, ya que en el modelo que presentamos, la carga no se transportaría a través del dímero CcmB, sino a lo largo de la interfaz CcmBC. Este no es el caso de otras flopasas conocidas, y aunque no podemos excluir que el dímero CcmB tenga una conformación abierta hacia afuera no vista hasta ahora, la suma de nuestros datos está mejor en línea con un modo de translocación que involucra a CcmC y su motivo WxWD. . Además, observamos la analogía con la escramblasa lipídica nhTMEM16, donde el transporte de lípidos también se produce a lo largo de un surco externo de la proteína integral de la membrana que de otro modo sirve como canal de cloruro43.

Utilizando la energía de la hidrólisis del ATP para transportar grupos hemo desde el interior a la lámina exterior de la membrana, Ccm(ABCD)2 actúa para mantener un conjunto celular de chaperonas CcmE móviles lateralmente cargadas con cofactores, listas para asociarse con el componente liasa CcmFGH. (I) para la unión covalente de su carga a un motivo de unión apocitocromo. Como tal, constituye una parte esencial de esta compleja maquinaria de modificación postraduccional, pero aún queda por responder la pregunta de por qué las hemo madurasas del sistema II del sistema Ccs pueden prescindir de este mecanismo. Sorprendentemente, se encuentran en organismos con genomas ricos en citocromos c, y los datos estructurales disponibles indican que estas liasas también poseen la puerta lateral hacia el folleto externo que observamos en CcmF y sugerimos que sea el sitio de inserción del hemo por CcmE18. En la actualidad, quedan preguntas centrales por responder, pero la imagen que cada vez más se centra en los ensamblajes de hemo madurasa es la de una maquinaria de modificación postraduccional sorprendentemente mecánica que consiste en partes móviles independientes coordinadas a través de cambios conformacionales que son impulsados ​​por fuerzas citoplasmáticas. Hidrólisis de ATP y procesos redox celulares.

El operón ccm de Escherichia coli se amplificó a partir del plásmido auxiliar de maduración del citocromo c pEC8621 y se clonó en un vector pASK-IBA (IBA Lifesciences), introduciendo un StrepTag(II) N-terminal (WSHPQFEK) en el producto génico de ccmA. Se produjeron complejos de Ccm recombinantes en cepas de E. coli BL21(DE3) o C43(DE3)44. Los cultivos se cultivaron en medio TB a 37 °C y agitación a 180 rpm hasta que la DO600 alcanzó 1-2, luego se inició la producción de proteínas mediante la adición de 0,2 µg·mL–1 de anhidrotetraciclina y la temperatura se redujo a 20 °C. Después de 14 a 16 horas de inducción, los cultivos se recogieron mediante centrifugación a 5000 x g a 4 °C (Avanti J-26 XP, Beckman Coulter). Los sedimentos celulares se resuspendieron en tampón de lisis con Tris/HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, y se rompieron mediante ultrasonicación (sonificador Branson 450 W, 70% de amplitud, 3 s de trabajo y 10 s de pausa). Luego, los extractos crudos se centrifugaron a 30.000 x g durante 30 minutos a 4 ° C para eliminar los restos celulares, y los sobrenadantes se ultracentrifugaron adicionalmente a 300.000 x g durante 1 h a 4 ° C para sedimentar la fracción de membrana. Los sedimentos de membrana se resuspendieron en 8 ml de tampón de lisis por gramo de membranas, se solubilizaron con n-dodecil-β-D-maltopiranósido (DDM) al 1% durante 1 h y se aclararon mediante centrifugación a 100.000 x g durante 30 min. Los sobrenadantes se cargaron en una columna de alta capacidad Strep-Tactin Superflow (IBA Lifesciences, volumen de lecho de 5 ml) equilibrada en tampón de lisis con DDM al 0,01%. Después del lavado, los complejos proteicos se eluyeron con tampón de lisis que contenía D-destiobiotina 5 mM, se concentraron con ultrafiltración y se purificaron adicionalmente mediante filtración en gel utilizando HiLoad Superdex 200 16/600 (GE Healthcare) equilibrado en tampón SEC (Tris/HCl 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, DDM al 0,01 % o GDN al 0,02 %). El intercambio de detergente por glicodiosgenina (GDN) se realizó durante la etapa de purificación por afinidad. Los complejos purificados se concentraron y se analizaron adicionalmente usando SDS-PAGE. Las bandas polipeptídicas en SDS-PAGE se identificaron mediante espectrometría de masas (Toplab). Todas las cepas bacterianas, plásmidos y cebadores se resumen en la Tabla complementaria 2.

Las muestras de CcmABCDE (GDN) y Ccm(E154QAB)2CD en una micela DDM después de la filtración en gel se concentraron a 10 mg·mL–1, se aplicaron a rejillas Quantifoil R 2/1 con descarga luminosa en una malla de cobre 300, se incubaron durante 5 s. , se secó durante 2 s con papel de filtro y se congeló instantáneamente en etano líquido enfriado con nitrógeno líquido usando un Vitrobot Mark III (Thermo Fisher) a 90% de humedad y una temperatura de 10 °C. El conjunto de datos para CcmABCDE en GDN se recopiló utilizando SerialEM45 en un microscopio electrónico de criotransmisión Glacios de 200 kV (Thermo Fisher) equipado con un detector de electrones directo Gatan K3 con un tamaño de píxel de 0,87 Å·px−1, 30 fotogramas y una exposición. tiempo de 4 s, con una dosis total de 50 e–·Å–2. El conjunto de datos para Ccm(E154QAB)2CD en DDM se recopiló en un TEM Titan Krios de 300 kV (Thermo Fisher) equipado con un detector Gatan K2 con un tamaño de píxel de 0,82 Å·px−1, 30 fotogramas y un tiempo de exposición de 4 s, con una dosis total de 50 e–·Å–2.

El flujo de trabajo detallado para el procesamiento de datos se resume en las figuras complementarias. 3 y 6. Para el conjunto de datos CcmABCDE (GDN), las pilas de películas sin procesar se corrigieron por movimiento con Relion46 y los valores de desenfoque por micrografía se estimaron utilizando CTFFIND v4.147. La selección inicial de partículas se realizó con una detección de manchas Laplaciana de Gaussiana y seguida de una selección basada en plantillas en Relion. Luego, las partículas extraídas se sometieron a varias rondas de clasificación 2D y las partículas seleccionadas como buenas se utilizaron para generar un modelo 3D inicial. Después de la clasificación 3D, dos clases mostraron una densidad bien resuelta para las características de la estructura secundaria, con una aparente doble simetría que indica el ensamblaje Ccm(ABCD)2. Una clase 3D también mostró densidad adicional para CcmE y se refinó a una resolución de 3,81 Å después del refinamiento CTF y el pulido bayesiano48 en Relion y el refinamiento no uniforme49 en CryoSPARC50. Las partículas de estas dos clases 3D también se combinaron y se colocaron con simetría C2 para alcanzar una resolución más alta de 3,47 Å para el complejo Ccm(ABCD)2.

El conjunto de datos para CcmE154QABCD (DDM) se procesó utilizando CryoSPARC50. La corrección del movimiento del parche y la estimación de CTF se realizaron antes de la recolección de partículas mediante el selector de manchas. Las clases 2D seleccionadas se utilizaron como entrada para el selector de plantillas. Después de la segunda ronda de clasificación 2D, se utilizaron clases 2D seleccionadas para una reconstrucción ab initio. Varias rondas de refinamiento heterogéneo y no uniforme mejoraron la resolución final del mapa a 3,94 Å con una composición de Ccm(E154QAB)2CD. Se procesó de manera análoga un segundo conjunto de datos para CcmE154QABCD (GDN) con ATP 2,5 mM agregado, hasta una resolución de mapa final de 3,62 Å. El criterio de correlación de capa de Fourier (FSC) estándar de oro de 0,143 se utilizó como estimación de la resolución del mapa51 (Figura complementaria 6). Los mapas Cryo-EM se visualizaron utilizando UCSF ChimeraX52.

SWISS-MODEL53 generó un modelo inicial para cada subunidad de CcmABCDE y lo ajustó rígidamente a los mapas de densidad utilizando ChimeraX52. La construcción del modelo se realizó manualmente en Coot54. Después del lanzamiento de AlphaFold224,55, se utilizó un modelo de CcmE derivado de este algoritmo para ajustar el mapa Ccm(ABCD)2E. Para todos los cálculos, se utilizó una instalación local de AlphaFold 2.1 en un servidor GPU. Las mejoras de los modelos iniciales se llevaron a cabo con refinamiento en el espacio real en PHENIX56, la calidad de la estructura fue validada por MolProbity57. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 1. Las figuras se generaron con PyMOL (Schrödinger LLC) o UCSF ChimeraX52.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los mapas de densidad y las coordenadas atómicas se han depositado en el Protein Data Bank (PDB) en http://www.pdb.org. Los mapas de densidad crio-EM también se depositaron en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB). Los números de acceso son: Ccm(ABCD)2: PDB 8CE1 y EMD-16597, (Ccm(ABCD)2E): PDB 8CE8 y EMD-16601, (Ccm(E154QAB)2CD): PDB 8CEA y EMD-16602, y (Ccm (E154QAB)2CD con ATP): PDB 8CE5 y EMD-16599.

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El plásmido pEC86 fue un generoso regalo de Linda Thöny-Meyer. Este trabajo fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (subvención n.° 310656) (OE) y Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC 1381, ID de proyecto 403222702, CRC 992, ID de proyecto 192904750 y RTG 2202, ID de proyecto 46710898) (OE) Agradecemos a M Chami por su excelente asistencia con la recopilación de datos en el laboratorio BioEM de Basel Biozentrum. Además, agradecemos al clúster bwHPC del estado federal de Baden-Württemberg y a la Deutsche Forschungsgemeinschaft (subvención INST 35/134-1 FUGG) por su soporte computacional.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Bioquímica, Universidad Albert Ludwig de Friburgo, 79104, Friburgo de Brisgovia, Alemania

Lorraine Ilcu, Lukas Denkhaus, Anton Brausemann, Lin Zhang y Oliver Einsle

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LI, AB, LZ y OE diseñaron los experimentos, LI, LD y LZ realizaron los experimentos, LI, LZ y OE procesaron datos, LI y LZ construyeron y refinaron el modelo estructural, y LI, LZ y OE escribieron el manuscrito. .

Correspondencia a Lin Zhang u Oliver Einsle.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Benjamin Orlando, Xiaodi Tang y los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Ilcu, L., Denkhaus, L., Brausemann, A. et al. Arquitectura del complejo CcmABCD/E translocador de hemo necesario para la maduración del citocromo c. Nat Comuna 14, 5190 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-40881-y

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Recibido: 02 de febrero de 2023

Aceptado: 15 de agosto de 2023

Publicado: 25 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-40881-y

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